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LEVEDURAS ENOLÓGICAS: PORQUE É IMPORTANTE A PREVALÊNCIA?

O CONCEITO DE PREVALÊNCIA EM ENOLOGIA E AS DIFICULDADES ASSOCIADAS AO PROCESSO DE PROPAGAÇÃO DA BIOMASSA.

A COMPETIÇÃO MICROBIANA NO MOSTO

A levedura selecionada é uma das pedras angulares da enologia moderna, que tem garantido a padronização dos processos fermentativos e maior controlo sobre os mesmos.

"Imagem de placa com meio de cultura com colónias de bactérias e leveduras"

Na fermentação enológica, ao contrário de outros setores como o cervejeiro (que, na maioria dos casos, também utiliza starters microbianos similares), a competição microbiana é um fator que pode exercer um papel decisivo na qualidade do produto final uma vez que as espécies selvagens, associadas à uva, podem determinar um significativo grau de variabilidade nas características do produto ou até mesmo no seu potencial final.

AS BIOTECNOLOGIAS E O DESENVOLVIMENTO DE NOVAS ESTIRPES DE LEVEDURAS

A uva, por si só, é uma matéria-prima que introduz no ambiente da adega um microbioma complexo, composto por leveduras e bactérias pertencentes a diferentes géneros (Oenococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Acetobacter, Gluconobacter, Hanseniaspora, Brettanomyces, Candida, Zygosaccharomyces, etc.).

É neste campo de batalha, o da competição microbiana, que a biologia e a seguir as biotecnologias deram a contribuição mais significativa nos últimos 60 anos. A investigação a nível internacional tem tentado isolar variantes fenotípicas, sempre mais eficazes, de leveduras enológicas a partir de vários ambientes (fermentações espontâneas, ambientes de adegas, superfícies dos bagos) e, onde não foi possível, recorreu a técnicas de breeding para efetuar um melhoramento genético de estirpes já existentes.

O resultado final destes esforços tem sido, ao longo dos anos, o desenvolvimento de estirpes de leveduras cada vez mais performantes, sem defeitos metabólicos e organoléticos (fermentações paradas ou lentas, elevação de acidez volátil, produção de sulfitos), mais resistentes aos estresses nutricionais e caracterizadas por recursos únicos (presença de atividades enzimáticas, reduzida produção de SO2, fenótipo killer, marcas aromáticas específicas, etc.).

A LEVEDURA SECA ATIVA COMO GARANTIA DE PREVALÊNCIA

Foi graças à introdução da Levedura Seca Ativa (LSA), compartilhada também por outros setores de atividade, que o importante trabalho de seleção acima referido foi dado a conhecer no mercado, incluindo as adegas a nível mundial, e num formato de fácil manuseamento, com substanciais benefícios em termos de transporte e principalmente de conservação a médio-longo prazo.

Utilizando a LSA, empresas como a AEB conseguem garantir o predomínio da levedura selecionada durante a fermentação. O conceito de prevalência é fundamental para o bom desenvolvimento tecnológico da fermentação: um starter microbiano prevalece quando assume o caráter de protagonista primário da fermentação, suplantando numericamente e metabolicamente a população “mista” das leveduras indígenas.

A possibilidade de utilizar uma levedura selecionada em enologia tem permitido melhorias significativas dos processos fermentativos, pois as LSA permitem:

 

  • 01
    Um completo e previsível andamento da fermentação alcoólica;
  • 02
    A redução da acidez volátil associada às fermentações espontâneas;
  • 03
    A redução das características organoléticas anómalas relacionadas com espécies microbianas indígenas;
  • 04
    A redução da presença de moléculas nocivas de origem microbiana, como as aminas biogénicas;
  • 05
    A correta gestão temporal e a potencial dissociação da fermentação maloláctica em relação à fermentação alcoólica.

A PREVALÊNCIA EM NÚMEROS

O conceito de prevalência é sinónimo não só de controlo do processo fermentativo na adega, mas também de qualidade do produto final bem como da sua reprodutibilidade. De facto, é necessário dispor do correto número de células para que as características do starter sejam expressas em pleno e que, da mesma forma, determinados defeitos organoléticos ou qualitativos ligados às espécies indígenas sejam expressos no vinho acabado.

Para compreender com exatidão a importância da utilização da levedura seca ativa em enologia é preciso, resumidamente, relembrar as condições microbiológicas de um mosto médio. Na verdade, se considerarmos que dentro de um mosto podem estar presentes de 103 a 105 células/mL de microrganismos “indígenas”, então, uma população de pelo menos 106 células de leveduras é estritamente necessária para quando se pretende obter a prevalência, ou seja, uma população de levedura superior em 10 vezes à dos microrganismos indígenas. Se considerarmos que uma preparação de LSA média consiste em cerca de 1010 células/g e que é recomendada a utilização de 20 g/hL, o número correspondente em relação à unidade de volume final é de 106 células/mL, o qual, de facto, representa o objetivo tecnológico associado a este processo e permite que a população do starter supere qualquer possível concorrente.

A PROPAGAÇÃO DA BIOMASSA

Nos tempos recentes, numerosas empresas produtoras de equipamentos tornaram-se improvisados especialistas em microbiologia e introduziram no mercado equipamentos indicados a uma presumível multiplicação das células de leveduras na adega, como sendo uma proposta tecnológica alternativa à LSA.

A alegação/reivindicação por trás de tais equipamentos (que geralmente não passam de simples tanques aos quais são aplicados um agitador e uma resistência com rudimentares circuitos de controlo) é que se pode estar em condições de multiplicar uma população celular derivada de LSA ou de uma levedura de diferentes ordens de grandeza, fresca, isolada in loco. Em muitos casos, afirmam poder obter uma multiplicação na ordem de 100 vezes com a consequente obtenção de culturas puras para depois poder utilizar como starter.

Com frequência, para comprovar a eficácia multiplicativa de tais técnicas, análises genéticas em colônias isoladas no final da fermentação são executadas. Através de técnicas como species assignment (pattern de restrição das regiões ITS, sequenciamento d2d2) e fingerprint molecular (regiões InterDelta, pattern amplificação de regiões microssatélites) demonstra-se a substancial identidade entre o starter utilizado para iniciar o multiplicador de biomassa e a estirpe de levedura isolada no final da fermentação.

OS LIMITES DOS PROCESSOS “ARTESANAIS” DE PROPAGAÇÃO DA LEVEDURA

No entanto, esta abordagem apresenta limitações, conceituais e técnicas, importantes:

 

  • 01
    Em primeiro lugar, é totalmente previsível que a maior parte da população de leveduras detetável no final de um normal andamento fermentativo seja representada pelo género Saccharomyces e, ainda mais em particular, S. cerevisiae. Este fenómeno deve-se à capacidade congênita desta espécie em resistir a altas concentrações alcoólicas, inclusive superiores a 12% de álcool onde, por sua vez, a maior parte das espécies contaminantes é inibida por tais valores.
  • 02
    Consequentemente, o estado microbiológico no final da fermentação não demonstra a sua verdadeira “história”. Em outras palavras, embora a concentração alcoólica do meio favoreça uma sobre-representação final do starter inoculado, os eventos envolvendo as primeiras fases fermentativas permanecem desconhecidos. Tal janela da falta de controlo microbiológico podem permitir o aparecimento de defeitos qualitativos relacionados com o metabolismo de espécies não selecionadas.
  • 03
    Ao contrário da aplicação da LSA, não há qualquer tipo de garantia sobre o número total de células inoculadas no início da fermentação, a qual permanecerá totalmente não verificável, exceto se houver a possibilidade de contá-las através de métodos como câmara de Bürker ou a contagem em meios tipo agar (disponíveis apenas nas adegas com laboratórios internos especializados). O mesmo problema repercute-se também sobre a impossibilidade de verificar a pureza microbiológica da população final obtida pelo processo de propagação.
  • 04
    A seleção “faça você mesmo” de estirpes de leveduras nos ambientes de adega apresenta muitas dificuldades de gestão. Não só seriam necessários, também neste caso, equipamentos de laboratório biológico para fazer a manipulação da estirpe (placas, materiais esterilizados, câmaras de fluxo laminar, autoclaves de esterilização, pessoal especializado), mas, as maiores limitações seriam dadas pela conservação a longo prazo, uma vez que para garantir a conservação das características fenotípicas no stock original é necessário o congelamento a -80ºC em solução de glicerol a 25%. Esta tecnologia, inviável na adega, é prerrogativa nas coleções microbianas, onde podem ser feitos controlos genéticos periódicos sobre as células e, portanto, monitorar o seu estado qualitativo.
  • 05
    As leveduras colocadas em tais multiplicadores não são cultivadas com melaço e nutrientes azotados estéreis; pelo contrário, são alimentadas com mosto de vinho ou com MCR, predispondo-as ao surgimento de contaminações provenientes de tais matérias-primas.
  • 06
    Um último ponto, mas fundamental, relacionado com a utilização de multiplicadores de biomassa é o possível aparecimento de mutações genéticas na levedura. Isto ocorre devido a um motivo muito simples e intuitivo: um microrganismo que cresce, de forma perpétua, num caldo de cultura (mesmo assumindo um 3% de álcool e um pH controlado de 4,5), não está realmente sujeito a qualquer pressão seletiva. Por isso, a funcionalidade de genes não “essenciais” para a reprodução neste ambiente pode ser perdida sem danos para a boa condição física da estirpe que, em vez disso, irá beneficiar da seleção positiva de variantes alélicas que favorecem a cinética de crescimento e a eficiente utilização dos nutrientes por parte de um metabolismo respiratório em vez de um metabolismo fermentativo. Da mesma forma, a estirpe em questão poderá perder funcionalidades ligadas às características originais para as quais foi selecionada em primeira instância, como uma marca/cunho aromático particular ou uma atividade enzimática, ou desenvolver alterações a nível de metabolismo que podem predispô-lo a maiores estresses diante de particulares condições nutricionais ou até mesmo à produção de níveis mais elevados de acidez volátil.

OS CUIDADOS A ADOTAR

"Sala da adega com cubas para a fermentação alcoólica"

O aspeto ardiloso (enganador) da aplicação das técnicas de multiplicação “artesanais” é que, de qualquer forma, quer sejam utilizados os métodos corretos ou não, elas levarão a algum tipo de resultado. Haverá sempre uma fermentação, ou seja, a produção de uma população de células das quais não se conhece a identidade nem o grau de pureza microbiológica.

Portanto, a propagação da levedura enológica através da utilização de multiplicadores como os acima referidos não pode, de forma alguma, prescindir da utilização da LSA que, inclusive neste contexto, deveria ser utilizada (como boa prática) para fazer uma periódica restauração da integridade genética original da estirpe. 

Em resumo, a adoção de processos de propagação de biomassa dentro das adegas, quando não conduzida com as corretas abordagens técnicas (redução da carga microbiana do caldo de cultura, reintegração periódica da população de leveduras com LSA), corre o risco de produzir efeitos adversos e de trair a própria razão pela qual os starter enológicos foram implementados.

Quando é pretendido adotar este tipo de abordagem na própria adega, é preciso ter inúmeros cuidados em termos de detergência, desinfeção e de controlo das variáveis de processo (temperatura, pH, agitação, vitalidade celular) e deve-se desconfiar categoricamente de qualquer abordagem simplista da multiplicação da biomassa que, ao contrário, exige um tratamento rigoroso e de alto nível biotecnológico, sob pena de perda, já a médio prazo, das características de qualidade e de reprodutibilidade do próprio processo.

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