与摩德纳-雷焦·艾米里亚大学合作开展的研究

起泡酒专用酵母

采用适应进化和育种策略筛选最佳发酵剂

起泡酒在葡萄酒酿造行业中占据着极为突出的地位，如今正受到越来越多消费者的欢迎。消费者对产品质量重视程度的日益提高，促使筛选适用于起泡工艺的最佳葡萄酒发酵剂成为研究课题。

起泡酒的生产和筛选酵母的应用

即便是小型酿酒厂，在瓶中或高压釜中生产起泡酒的技术也已经非常成熟。但是，如果执行不当，就会导致各种发酵失败。

最常见的不良影响包括：

压力过大造成爆瓶；
葡萄酒回味苦涩、沉淀过多；
葡萄酒瓶内浑浊；
葡萄酒未二次发酵；
葡萄酒带有氧化味。

为了避免出现上述问题并生产出质量上乘的起泡酒，必须充分了解发酵机制，密切关注从葡萄酿造到起泡法选择等每一个生产环节，但其中最关键的，是必须选对发酵剂。

使用不合适的酵母会造成发酵减缓乃至发酵中断，进而损害最终产品。

二次发酵及其对酵母菌的不良影响

二次发酵，无论是在瓶中还是在高压釜中，都会造成酵母发酵性能受限，这是由于酵母受到了下列应激环境的影响：

pH值低至2.8-3.5；
乙醇浓度高达11%-12%；
CO₂分压高达7-8 atm；
有机酸浓度高；
二氧化硫浓度高达约50-80 mg/L；
发酵温度低至10-15°C。

此外，氧气不足会阻止甾醇和不饱和脂肪酸的合成，从而改变酵母细胞膜的功能。

科学试验证实，生产过程中CO₂的积累会对酵母造成负面影响，降低酵母的活性及其发酵活力。

弱有机酸及其对细胞代谢的影响

为了更好地了解这些影响，我们必须考虑弱有机酸的作用。弱有机酸会对细胞的新陈代谢产生影响，影响方式与二氧化碳类似。

事实上，即使在较低浓度下，CO₂也会形成碳酸，即弱酸。如果测定碳酸和其他弱有机酸的酸解离常数，可以发现测定值大致相似。因此，这些分子在细胞间质和细胞外基质中的解离状态也是相似的。

pH值约为3-3.5的弱有机酸以非解离态XCOOH存在，在这种状态下，它们能够自由进入pH值为7.4的细胞内部。在7.4 pH值下，XCOOH解离为羧基阴离子XCOOH-和H+离子。羧基阴离子无法离开细胞膜，因而在细胞质内积聚，所形成的的压力会诱发多种细胞反应，如果不加以控制，甚至会造成细胞凋亡。

采用适应进化策略筛选酵母

因此，我们尝试以弱有机酸（如不同浓度的乙酸、山梨酸或苯甲酸）为应激因子，采用适应进化策略，对适用于起泡酒酿造的酵母培养物进行潜在筛选。一般来说，利用进化原理，获得具有工业所需特定表型的菌株非常有效。进化适应方法的核心是基因重组过程中产生的遗传变异性，正是遗传变异性帮助我们筛选出具备特定特征的改良型菌株。

特别是减数分裂重组过程，基因重排使获得不同类型的单倍体细胞成为可能，因此在筛选杂交菌株时尤其有效。在实践中，杂交被用作新的遗传变异的来源。这种方法也可用于育种计划，来获得种内和种间杂交菌株。

种间育种获得的新型酵母菌株

进化方法也可以应用于育种计划，来获得种内和种间杂交菌株。在菌种保藏中心（UMCC）研究组开展的第一项工作中，即使用前文提到的进化方法，获得了一种新型酿酒酵母菌株，其保藏号为UMCC 2949，具有特定的表型特征，如耐弱有机酸。

为了验证“即使在高CO₂浓度下，菌株的发酵能力也与阻力相符”的实验假设，我们在原型高压釜中进行了起泡酒测试，所选菌株表现良好。

为了进一步改良UMCC 2949菌株，使其在耐弱有机酸的同时具备更好的耐低温性，随后采用了种间育种策略，将酿酒酵母菌株与UMCC 2633葡萄汁酵母菌株进行杂交。为了确认杂交菌株的形成，通过对rNA的ITs-5,8s区域进行“菌落PCR方法”和RFLP（限制性片断长度多态性）分析，在分子水平上，对两个亲代菌株的孢子进行不同杂交所获得的菌落进行表征（见下图1）。

图1

种间育种策略示意图：

a)酿酒酵母和葡萄汁酵母菌株的直接孢子-孢子杂交；

b) 对杂交培养物进行分子表征；

c) 表型筛选；

d) 进行发酵测试，评估杂交菌株的性能。

新型酵母的发酵性能

随后，在两种不同的温度条件下（分别为15和27°C），对所筛选的名为UMCC 3008的杂交菌种进行选择性环境测试，验证其对12%和15%乙醇的耐受性，以及对50mM和75mM浓度乙酸的耐受性。在烧瓶中添加补充了蔗糖、最终浓度为30g/L的基酒，采用微葡萄酒酿造测试法，对UMCC 3008杂交菌种的发酵性能进行初步评估。最后，采用BIGGY琼脂培养基试验，对硫化氢产生量进行定性评估。

研究结果

新杂交菌株UMCC 3008和UMCC2949菌株的表型筛选显示结果如下（见下表1）：

在测试条件下对乙醇的耐受性；
对高达50mM的乙酸浓度的耐受性；
H₂s产生量极低；
对表型筛选中所用的选择性压力具有良好的耐受性；
在微葡萄酒酿造试验中具有极好的发酵适应性。

因此，我们认为，在通过进一步的实验验证其发酵性能及其对起泡酒生产的潜在适用性后，该杂交菌株将成为一种极好的发酵剂。

UMCC编号	菌种	乙醇12%		乙醇15%		乙酸50mM	乙酸75mM	H₂S（BIGGY琼脂）
		15°	27°	15°	27°	27°	27°	27°
UMCC 2949	*S. cerevisiae*	+	+	+	+	+	+	中等的
UMCC 2633	*S. uvarum*	+	+	-	-	+	-	极低
UMCC 3008	*S. cerevisiae x S. uvarum*	+	+	+	+	+	-	极低

表1
使用YPDA培养基，添加12%或15%乙醇，在15°C和27°C下培养，进行耐乙醇筛选。使用酵母氮源基础培养基（YNB），添加50mM或75mM乙酸，进行耐乙酸筛选。此外，在平板培养6天后，使用BIGGY琼脂培养基，对硫化氢产生量进行定性评估。

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