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Estudio realizado en colaboración con la Universidad de Modena y Reggio Emilia

LEVADURAS PARA VINOS ESPUMOSOS

Estrategias de evolución adaptativa y de breeding para la selección de starters optimizados

Los vinos espumosos ocupan una posición muy importante en el sector vitivinícola y su creciente popularidad entre los consumidores, cada vez más atentos a la calidad del producto, fomenta también la investigación hacia la selección de starter optimizados para el proceso de elaboración de espumosos.

LA ELABORACIÓN DE VINO ESPUMOSO Y EL USO DE LEVADURAS SELECCIONADAS

La elaboración de vino espumoso en botella o en autoclave es una práctica consolidada incluso a nivel de pequeñas bodegas. Sin embargo, esta práctica, si no se realiza correctamente, es la causa de varios fracasos.

Los efectos secundarios más comunes son:

  • ● la explosión de las botellas, por exceso de presión;
  • ● un vino con regusto amargo y con demasiado sedimento;
  • ● un vino que permanece velado en la botella;
  • ● un vino que no refermenta;
  • ● olores a reducido.

Para superar estos problemas y elaborar un buen vino espumoso, es necesario conocer bien los mecanismos de la fermentación y prestar mucha atención a todas las etapas de la elaboración, desde la vinificación de la uva hasta la elección del método de elaboración del vino espumoso, pero sobre todo es necesario elegir una cepa starter.
El uso de levaduras inadecuadas puede comprometer el producto final, ralentizando o bloqueando de forma anómala el proceso.

REFERMENTACIÓN Y EFECTOS INDESEABLES SOBRE LAS LEVADURAS

La refermentación, en botella o en autoclave, es un proceso bastante limitante para las levaduras, dado que están sometidas a condiciones estresantes como:

  • ● un pH entre 2,8 y 3,5;
  • ● una concentración de etanol de 11% - 12%;
  • ● una alta presión parcial de CO2 (de hasta 7-8 atm);
  • ● una alta concentración de ácidos orgánicos;
  • ● una alta concentración de anhidrido sulfuroso, alrededor de 50-80 mg/L;
  • ● bajas temperaturas de fermentación, comprendidas entre 10 y 15 °C.

Además, la falta de oxígeno impide la síntesis de esteroles y de ácidos grasos insaturados, alterando la funcionalidad de la membrana celular de las levaduras.
La evidencia científica confirma los efectos indeseables sobre las levaduras, en términos de reducción de la actividad y del vigor fermentativo, debido a la acumulación de CO2 durante el proceso.

LOS ÁCIDOS ORGÁNICOS DÉBILES Y SU INFLUENCIA EN EL METABOLISMO CELULAR

Para comprender mejor estos efectos, es necesario tener en cuenta la acción de los ácidos orgánicos débiles, que influyen en el metabolismo de la célula de forma similar a como lo hace el dióxido de carbono.
El CO2, de hecho, aunque en bajas concentraciones, forma ácido carbónico, que es un ácido débil. Si evaluamos las constantes de disociación ácida del ácido carbónico y otros ácidos orgánicos débiles, se puede observar que tienen valores aproximadamente similares, por lo que el estado disociativo de estas moléculas en las matrices intra y extracelulares será razonablemente similar.
Los ácidos orgánicos débiles con un valor de pH de alrededor de 3-3,5, se encuentran en la forma no disociada XCOOH, en este estado pueden entrar libremente a la célula donde el pH es de 7,4.
A este valor, los iones XCOOH- y H+ se disocian en el anión carboxílico. Los aniones carboxilo no pueden salir pasivamente de la membrana y se acumulan dentro del citoplasma. Esta acumulación induce diversas respuestas celulares al estrés y si no se controla, también puede inducir la apoptosis.

LAS ESTRATEGIAS DE EVOLUCIÓN ADAPTATIVA PARA LA SELECCIÓN DE LEVADURAS

De ello se deduce que una potencial selección de cepas de levadura adecuadas para la espumatización puede ser obtenida con estrategias de evolución adaptativa, utilizando ácidos orgánicos débiles, con diferentes concentraciones de ácido acético, ácido sórbico o ácido benzoico, como factor de estrés. En general, los enfoques basados ​​en principios evolutivos son muy eficaces para obtener cepas con fenotipos específicos requeridos en el campo industrial. El punto clave para el enfoque de adaptación evolutiva es la variabilidad genética que se origina en los procesos de recombinación, que aumentan la probabilidad de seleccionar las cepas mejoradas para las características de interés.

De forma particular, los procesos de recombinación meiótica son particularmente efectivos en el caso de las cepas heterocigóticas, ya que la mezcla de los genes permite obtener un conjunto diferente de células haploides. En la práctica, el crossing over se utiliza como fuente de nueva variabilidad genética. Este enfoque también se puede aplicar en programas de breeding para obtener híbridos tanto intra como interespecíficos.

LA NUEVA CEPA DE LEVADURA OBTENIDA MEDIANTE MEJORA INTERESPECÍFICA

El enfoque evolutivo también se puede aplicar en programas de mejora para obtener híbridos tanto intra como interespecíficos. En un primer trabajo realizado por el grupo de investigación de la Unimore Microbial Culture Collection (UMCC), el enfoque evolutivo, anteriormente descrito, ha permitido obtener una nueva cepa de Saccharomyces cerevisiae, depositada con el código UMCC 2949, con las características fenotípicas de interés, como resistencia a ácidos orgánicos débiles.
Con el fin de validar la hipótesis experimental de correspondencia con la resistencia a altas concentraciones de CO2, se realizaron pruebas de espumatización en prototipos de autoclave, en los que la cepa seleccionada ha funcionado.
Para mejorar posteriormente la cepa UMCC 2949 confiriéndole también una mayor resistencia a las bajas temperaturas se ha aplicado posteriormente una estrategia de breeding interespecífica, cruzando la cepa de S. cerevisiae con la cepa UMCC 2633 de la especie S. uvarum. Las colonias resultantes de los diferentes cruces entre las esporas de las dos cepas parentales se caracterizaron a nivel molecular, mediante análisis "colony PCr" y RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) de la región ITs-5.8s del rNA, con el fin de confirmar la formación de híbridos (ver a continuación Figura 1).

Figura 1

Representación esquemática de la estrategia de breeding específico:

a) cruce espora-espora directo entre la cepa S. cerevisiae y S. uvarum;

b) caracterización molecular de los cultivos derivados de los cruces;

c) tamizaje fenotípico;

d) pruebas de fermentación para evaluar el comportamiento del híbrido.

EL RENDIMIENTO DE FERMENTACIÓN DE LA NUEVA LEVADURA

Posteriormente, el híbrido seleccionado, denominado UMCC 3008, ha sido testado en medios selectivos para verificar la tolerancia al etanol de 12% y 15%, en dos diversas condiciones de temperatura, respectivamente 15 y 27°C, y la resistencia al ácido acético en concentraciones de 50 mM y 75 mM. El comportamiento fermentativo del híbrido UMCC 3008 se evaluó preliminarmente en pruebas de microvinificación realizadas en matraces con vino base adicionado con sacarosa a la concentración final de 30g/L. Finalmente, se realizó una prueba en medio de crecimiento BIGGY agar para una estimación cualitativa de la producción de sulfuro de hidrógeno.

RESULTADOS DE LA INVESTIGACIÓN

Los exámenes fenotípicos han evidenciado los siguientes resultados para el nuevo hibrido UMCC 3008 y de la cepa UMCC2949 (ver la tabla 1 inferior):

  • ● tolerancia al etanol en las condiciones probadas;
  • ● resistencia a concentraciones de ácido acético hasta 50 mM;
  • ● baja producción de H2S;
  • ● buena tolerancia a las presiones selectivas aplicadas en el cribado fenotípico;
  • ● excelente aptitud fermentativa en pruebas de microvinificación.

Por lo tanto, se cree que este híbrido y su ancestro son excelentes candidatos como cultivos starter para ser validados mediante posteriores experimentos con el fin de confirmar su desempeño fermentativo y su aptitud para la producción de vinos espumosos.

Tabla 1
Cribado de resistencia al etanol, realizado en medio YPDA adicionado con etanol al 12% o al 15% (incubación a 15°C y 27°C) y al ácido acético, realizado en medio mínimo Yeast Nitrogen Base (YNB) con ácido acético adicionado 50 mM o 75mM, además, VALORACIÓN cualitativa de la producción de H2S en medio BIGGY agar, después de 6 días de incubación de las placas.